第十五章核酸的研究方法-PPT精品文档

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第十五章 核酸的研究方法1、核酸的分离、提纯和定量测定? DNA的分离 ? RNA的分离 ? 核酸的定量Isolation of Nucleic AcidsGoals:? removal of proteins ? DNA vs RNA ? isolation of a specific type of nucleic acidTypes of Methods:? differential solubility ? ‘adsorption’ methods ? density gradient centrifugationTypes of DNA:? genomic (chromosomal) ? organellar (satellite) ? plasmid (extrachromosomal) ? phage/viral (ds or ss) ? complementary (mRNA)General Features:? denaturing cell lysis (SDS, alkali, boiling, chaotropic) ? ? enzyme treatments -protease -RNase (DNase-free) -DNase (RNase-free)Collection of cellsUse soft brushes to dislodge epithelial cells lining the mouth.Ample cell collection is very critical for success.Lysis buffer? What’s in Lysis Buffer? – Tris buffer to maintain pH of solution so that DNA is stable– SDS to dissolve membranes of cell, allowing DNA to be released into solution– SDS also denatures proteins, making them more susceptible to protease cleavageO O O S O - CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH3SDSWhy add Protease?? Protease destroys nuclear proteins that bind DNA, and cytoplasmic enzymes that breakdown and destroy DNA (nucleases) ? Protease treatment increases the yield of DNAAdding salt (5M NaCl)? Na+ binds to phosphate groups of DNA, neutralizing the electric charge of DNA ? NaCl allows DNA molecules aggregate instead of repelling each other, making it easier for DNA to precipitate out of solution when alcohol is addedAdding ice cold alcohol? DNA cannot dissolve in alcohol ? The addition of cold alcohol makes the DNA clump together and precipitate out of solution? Precipitated DNA molecules appear as long pieces of fluffy, stringy, web-like strandsDNA Precipitation? Microscopic oxygen bubbles “aggregate” or “fuse” together, simultaneously with the DNA precipitation? The larger, visible air bubbles act to “lift” the DNA out of solution, from the aqueous into the organic phaseHigh MW Genomic DNA IsolationTypical Procedure1 Cell Lysis– 0.5% SDS + proteinase K (55o several hours)Phenol Extraction? mix sample with equal volume of sat. phenol soln ? retain aqueous phase ? optional chloroform/isoamyl alcohol extraction(s)2 Phenol Extraction– gentle rocking several hours3 Ethanol Precipitation 4 RNAse followed by proteinase K 5 Repeat phenol extraction and EtOH ppt? aqueous phase (nucleic acids) ? phenol phase (proteins)High MW Genomic DNA IsolationTypical Procedure1 Cell Lysis– 0.5% SDS + proteinase K (55o several hours)EtOH Precipitation? 2-2.5 volumes EtOH, -20o ? high salt, pH 5-5.5 ? centrifuge or ‘spool’ out2 Phenol Extraction– gentle rocking several hours3 Ethanol Precipitation 4 RNAse followed by proteinase K 5 Repeat Phenol Extraction and EtOH pptIsolation of RNASpecial Consid

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